การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียร์ (deviation from Beer's law)
 
           เราทราบมาแล้วจากกฎของเบียร์ว่า ค่าการดูดกลืนจะแปรผันโดยตรง
กับความเข้มข้น ดังนั้นเมื่อเราพล็อตกราฟระหว่างค่าการดูดกลืน (A) กับ
ความเข้มข้น (c) เมื่อความหนาของเซลล์คงที่ จะได้กราฟเส้นตรง แต่ในบางครั้งพบว่าอาจจะเกิดการเบี่ยงเบนได้ความสัมพันธ์ที่ไม่เป็นเส้นตรง ซึ่งอาจเป็นการเบี่ยงเบนในเชิงบวก (positive deviation) คือค่าการดูดกลืนให้แนวโน้มสูงกว่าปกติ ทำให้กราฟที่ได้โค้งขึ้น หรือเป็นการเบี่ยงเบนเชิงลบ (negative deviation) คือค่าการดูดกลืนมีแนวโน้มต่ำลงทำให้กราฟโค้งลง
 
 รูปที่ 2.6 แสดงการเบี่ยงเบนที่ไม่เป็นไปตามกฎของเบียร์
 

           ซึ่งการเบี่ยงเบนดังกล่าวมาจากสาเหตุหลัก 2 ประการ ได้แก่
           1. การเบี่ยงเบนทางเคมี (chemical deviation)
           2. การเบี่ยงเบนจากเครื่องมือ (instrumental deviation)
      
การเบี่ยงเบนทางเคมี (chemical deviation) เกิดจากสารที่ต้องการวิเคราะห์เกิดการสลายตัว การรวมตัว หรือทำปฏิกิริยากับตัวทำละลาย แล้วกลายเป็นสารตัวอื่นที่ให้ absorption spectrum ต่างจากสารที่ต้องการจะวิเคราะห์   ทำให้ผลเบี่ยงเบนออกจากกฎของเบียร์ ยกตัวอย่างเช่น การรวมตัวกันของโมเลกุล ทำให้การดูดกลืนแสงต่อโมเลกุลลดลง ดังนั้นจึงเกิดการเบี่ยงเบนเชิงลบ

Isosbestic point
          บ่อยครั้งที่การวัดค่าการดูดกลืนเกิดขึ้นในขณะที่สารนั้นสามารถอยู่ในรูปร่างที่ดูดกลืนแสงได้หลายความยาวคลื่น เช่น methyl red ซึ่งเป็นอินดิเคเตอร์ (indicator)
ชนิดหนึ่ง สามารถเปลี่ยนรูปร่างเป็น HIn (สีแดง) และ In- (สีเหลือง) ได้ในช่วง pH 5.1
          จากรูปที่ 2.7 สเปกตรัมของ methyl red ในช่วง pH ระหว่าง 4.5-7.1 จะเห็นว่า methyl red มีพีคการดูดกลืน 2 พีคคือ ที่ประมาณ 530 nm เป็นพีคการดูดกลืนของ HIn ส่วนที่ประมาณ 410 nm เป็นของ In-  อย่างไรก็ตาม  สเปกตรัมที่ทุกๆ สภาวะจะมีจุดตัดร่วมซึ่งเราเรียกว่า Isosbestic point  ซึ่งเป็นจุดที่ methyl red ไม่มีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง ดังนั้นเราสามารถเลือกใช้ความยาวคลื่นที่จุดนี้สำหรับการวัดค่าการดูดกลืน ซึ่งจะทำให้หมดปัญหาเรื่องการรบกวนจากการเปลี่ยนรูปร่าง ถ้าต้องการเลือกใช้ที่ความยาวคลื่นอื่นๆ เรามีความจำเป็นต้องควบคุม pH ให้คงที่โดยการใช้บัฟเฟอร์ เพื่อให้การเปลี่ยนรูปร่างของสารคงที่ตลอดเวลา

 
รูปที่ 2.7 แสดง  isosbestic point  ของ methyl red
 
 Quiz
    อินดิเคเตอร์ชนิดหนึ่งมีพีคการดูดกลืน 2 พีคที่ 480 nm (HIn) และที่ 635 nm
 (In-) ทั้งสองรูปร่างมีค่า molar absorptivity () ดังตาราง ถ้านำตัวอย่างอินดิเคเตอร์
 ชนิดนี้ซึ่งมีอยู่ 25 mL มาเจือจางเป็น 50 mL แล้วไปวัดค่าการดูดกลืนที่ทั้งสอง
 ความยาวคลื่น พบว่า ได้ค่าการดูดกลืนเป็น 0.533 และ 0.590 ตามลำดับ
    จงหาว่าในตัวอย่างอินดิเคเตอร์นี้มีความเข้มข้นของ HIn และIn- อยู่อย่างละ
 เท่าใด เมื่อใช้เซลล์ขนาด 1cm
                                                     molar absorptivity,
                                                 480 nm                   635 nm
            HIn                            3.55 x 103              5.64 x 102
            In-                              2.96 x 103             1.45 x 104

 แนวคิด
     ที่ 480 nm;            A  =  (cl)HIn +  (cl)In

                             0.533 =  ( 3.55 x 103 M-1 cm-1x 1cm x cHIn)

                                            +  ( 2.96 x 103 M-1 cm-1x 1cm x cIn)

                    จะได้     cHIn =   0.533 - 2.96 x 103 M-1 cm-1 x cIn
                                             ----------------------------------------------     (1)
                                                    3.55 x 103 M-1 cm-1

      ที่ 635 nm;           A  =  (cl)HIn +  (cl)In

                             0.590 =  ( 5.64 x 102 M-1 cm-1x 1cm x cHIn)

                                            +  ( 1.45 x 104 M-1 cm-1x 1cm x cIn)      (2)

      แทนค่า  cHIn จากสมการที่  (1) ลงใน  (2) แล้วแก้สมการ จะได้

                    ดังนั้น    cIn   =   3.60 x 105 M
                                cHIn  =   1.20 x 104 M

     แต่เนื่องจากมีการเจือจางตัวอย่างเป็นสองเท่า ดังนั้น ความเข้มข้นของ
 HIn ในตัวอย่างมี 2.40 x 104 M และ In- มี 7.20 x 105 M   
 
การเบี่ยงเบนจากเครื่องมือ (instrumental deviation) เกิดจาก
1. ความไม่แม่นยำของเครื่องมือวัด ในทางปฏิบัติพบว่าการวัดค่าการดูดกลืนของสารให้มีค่าอยู่ในช่วง A = 0.1-1.0 จะมีความคลาดเคลื่อนของการวัดความเข้มข้นน้อยมากประมาณ 1-2% ดังนั้นในปฏิบัติการจริงจะมีการปรับความเข้มข้นของสารละลายให้อยู่ในช่วง A = 0.1-1.0  ถ้าค่าการดูดกลืน อยู่ในช่วงที่มากกว่า หรือน้อยกว่านี้แสงที่ผ่านออกมายังเครื่องตรวจวัดจะน้อยหรือมากเกินไป ดังนั้นความคลาดเคลื่อนจึงมีสูง
                      
 
รูปที่ 2.8   %ความเข้มข้นที่คลาดเคลื่อน (% error in concentration)
อันเนื่องมาจากความคลาดเคลื่อนในการอ่าน
ค่าการดูดกลืน (absorbance) ของเครื่องมือ
 
2. แสงที่มีหลายความยาวคลื่น (polychromatic light) จากกฎของเบียร์อนุมานว่า
ความยาวคลื่นที่ผ่านสารละลายเป็นความยาวคลื่นเดี่ยว แต่ในทางปฏิบัติ ตัวแยกความยาวคลื่น (monochromator) อาจแยกความยาวคลื่นให้เป็นคลื่นเดี่ยวไม่ได้ มีความยาวคลื่นอื่นปนมาด้วย ดังนั้นการวัดค่าการดูดกลืน อาจคลาดเคลื่อนได้ ถ้าความยาวคลื่นอื่นที่ปนมามีค่า molar () ของสารเปลี่ยนแปลงไปจากความยาวคลื่นที่เราเลือกมาก
 
 
รูปที่ 2.9 ผลของแสงที่มีหลายความยาวคลื่นต่อการเบี่ยงเบนจากกฎของเบียร์ :
แถบ A เป็นไปตามกฎของเบียร์เพราะ เปลี่ยนแปลงไม่มาก
        แถบ B ไม่เป็นไปตามกฎของเบียร์ เพราะ เปลี่ยนแปลงอย่างมาก
 
3. คลื่นแสงรบกวน (stray light) คือการรบกวนของความยาวคลื่นที่เราไม่ได้เลือก
ผ่านเข้าไปตกกระทบบนตัวตรวจจับสัญญาณ (detector) อาจเกิดจากการกระเจิงแสง (scattering) หรือการสะท้อน (reflection) หลายๆ ครั้งบนผิวของเกรตติ้งเลนส์ หรือฟิลเตอร์ เป็นต้น ผลของแสงรบกวนทำให้ค่าการดูดกลืนลดลง โดยเฉพาะที่ความ
เข้มข้นสูงๆ ถ้าค่าการดูดกลืนมีค่ามาก แสงที่ผ่านออกมาตกบนตัววัดมีน้อย ดังนั้นแสงรบกวนจึงส่งผลได้มากขึ้น ทำให้ได้กราฟที่ไม่เป็นเส้นตรง
 
 
รูปที่ 2.10 อิทธิพลของคลื่นแสงรบกวน (stray light)
 
ยกตัวอย่างเช่น สมมติว่าเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เครื่องหนึ่ง จะมีผลของแสง
รบกวน 1% ของทุกๆครั้งที่ทำการวัด จากตารางเปรียบเทียบปริมาณของแสงรบกวนกับ
ค่าการดูดกลืนแสงต่างๆ พบว่า
 
absorbance %T %stray light ratio of
%(stray light / T)
0 100 1 1/100
1 10 1 1/10
2 1 1 1/1
 
     ถ้าค่าการดูดกลืนแสงยังมีค่าน้อยหรือแสงที่ผ่านออกมา (%T) ยังมีค่ามาก
ผลของแสงรบกวนจะถือว่ารบกวนน้อย เช่นแสงรบกวน 1% มีค่าน้อยมากเมื่อเทียบกับ
แสง100%T (แสงรบกวนคิดเป็น 0.01%ของค่า%T) แต่เมื่อไรก็ตามที่ค่าการดูด
กลืนมีค่ามากจนกระทั่งแสงที่ผ่านออกมาเหลือน้อยมาก เช่น แสงผ่านออกมา
เพียง 1%T ดังนั้นแสงรบกวนซึ่งมี 1% จะมีค่าเท่ากันกับแสง %T เลยทีเดียวหรือ
แสงรบกวนคิดเป็น 50 % ของแสง %T