เพื่อพิสูจน์ว่าการตรึงคาร์บอนไดออกไซด์เกิดขึ้นเป็นวัฎจักร

         เมื่อใส่  CO₂  ในรูป  C¹⁴  (HC¹⁴O^-₃) ให้แก่สาหร่ายสีเขียว  เช่น  Chlorella (พืช C3)  และถ้าฆ่าสาหร่ายเหล่านี้โดยใช้ความร้อนในเวลาต่าง ๆ กัน (วินาที)  เพื่อหยุดการทำงานของเอนไซม์  พบว่าสารที่ติดฉลากกัมมันตรังสีตัวแรก จะเป็น  3-PGA  (3-phosphoglycerate)  ซึ่งลดลงอย่างรวดเร็วตามเวลา  และตามมาด้วย GAP (glyceraldehyde  3- phosphate) และ  malic acid  อย่างช้า ๆ และ R 1,5 BP (ribulose 1,5 bisphosphate) ตามลำดับ (รูปที่ 1)   Calvin  และ  Benson  สามารถประกอบวัฏจักรคัลวินจากข้อมูลเพิ่มเติมคือ ขณะที่ปริมาณของ 3PGA  เพิ่มจากตรึง  CO₂   อย่างรวดเร็วปริมาณ  R 1,5 BP  จะลดลงอย่างรวดเร็ว (รูปที่ 2)

รูปที่ 1

รูปที่ 2

    แต่  M.Hatch  และ  R.Slack   พบว่าในพืช C4 เช่น อ้อย  ข้าวโพด นั้น  ¹⁴CO₂ ทำให้เกิด C¹⁴ -  C₄ acid เช่น  malic acid   ก่อน  และตามด้วย  3-PGA (รูปที่ 3)  จึงทำให้คิดว่ามีกลไกตรึง  CO₂   เพิ่มขึ้นอีกชั้นหนึ่งในพืช  C4  ก่อนที่จะเข้าไปในวัฏจักรคัลวิน         

รูปที่ 3